Princípio do Método Imunoensaio para Determinação da Concentração Sanguínea de Insulina Bovina em Microplacas de Elisa

A insulina é o principal hormônio responsável pela regulação da glicemia em mamíferos, incluindo humanos. É sintetizada no pâncreas, como precursor pró-insulina, pelas células-beta das ilhotas de Langerhans. Em seguida, metabolizada para formar peptídeo C e insulina, que são secretados na circulação em quantidades equimolar. A insulina bovina difere da humana em três resíduos de aminoácidos, e da suína em um resíduo.  A molécula de insulina madura consiste de duas cadeias polipeptídicas, cadeia A e cadeia B (21 e 30 aminoácidos, respectivamente), unidas por duas pontes dissulfeto.

O método analítico descrito a seguir para determinação da concentração sanguínea de insulina consiste em um teste imunoensaio em fase sólida de dois pontos.

A metodologia é baseada no princípio da técnica de sanduíche direta, na qual dois anticorpos monoclonais são dirigidos contra determinantes antigênicos distintos na molécula de insulina. Na fase de incubação, as moléculas de insulina presentes na amostra reagem com anticorpos anti-insulina fixados nos poços da microplaca. Na sequência é adicionado um conjugado anti-insulina/peroxidase, que liga-se à molécula de insulina sanguínea aderida ao anticorpo anti-insulina da microplaca (Figura abaixo).  A enzima-anticorpo marcado não ligado é removido com uma simples lavagem. A enzima conjugada ligada é detectada por reação com 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). A reação é interrompida pela adição de uma solução stop, proporcionando um ponto final colorimétrico e lida espectrofotometricamente à 450nm.

Cada kit contém reagentes para 96 poços, suficiente para 42 amostras e uma curva de calibração em duplicata. O cálculo da insulina é obtido por interpolação dos resultados com uma regressão cúbica da curva de calibração obtida. Tanto amostras de soro quanto plasma podem ser analisadas. As amostras de soro deverão ser coletadas por punção venosa, permetidindo a coagulação e sua separação por centrifugação. As amostras de plasma também deverão ser coletadas por punção venosa em tubos contendo heparina ou EDTA como anticoagulante e separadas por fração de plasma.  As amostras obtidas deverão ser transferidas para tubos eppendorf e armazenadas entre 2 a 8 °C;  neste caso, a concentracao de insulina deve ser determinada em até 24 horas após a coleta. Para períodos mais longos, as amostras deverão ser armazenadas a -20°C, evitando-se congelamento e descongelamento repetidos.

A vantagem deste procedimento analitico (IMUNOENSAIO) comparado ao teste radioemunoensaio (RIA) é que as amostras podem ser analisadas em laboratórios não credenciados ao CNEN, dispensando também a necessidade de uma pessoa qualificada pelo mesmo orgão.

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